單孢培養即純種的建立，也稱純化培養。無論是野外或田間采集的土壤，還是誘導培養後，獲得的大量AMF孢子都是不同的屬種混合在一起，必須将形态上不同的孢子分别挑出來接種到宿主植物上進行純化培養，即可收集到足量的、純淨的AMF菌種資源。
單孢培養是從小心仔細地選擇孢子開始的。孢子可以從田間得到，隻要是健康并能侵染的都可以，但成功的可能性由于土壤類型、有機質含量和環境狀況或季節有很大的差異。
步驟：
1. 接種前3-4 d用濕篩法從誘導培養的土壤中提取孢子。将形态各異的孢子放到裝有滅菌蒸餾水的不同表面皿中區分擺放，放入4 °C冰箱保存，每天清洗（持續3-4 d）并去除失活和破損孢子，保留潔淨、新鮮、光亮、飽滿的孢子備用。
2. 按質量控制要求準備高粱種子（參見“質量控制”部分）、滅菌的沸砂基質、50穴苗盤、塑料花盆和潔淨的水，備用。
3. 50穴苗盤裝入滅菌的沸砂基質至每穴2/3處，用潔淨的水澆透。使用裝有200 µl槍頭的移液器（量程20-200 µl）在體視鏡下吸取孢子，直接滴放在裝好并澆水的基質上，每穴放1個孢子，再加蓋1-2 cm滅菌沸砂基質于孢子上，補适量潔淨的水，播種催芽的高梁種子2-3粒，覆蓋0.5-1 cm滅菌的沸砂基質。
4. 放置光照培養室培養（培養條件參見“質量控制”部分）。6-7周後将單孢培養苗盤中的高梁苗與培養物一起取出，放在已消毒的塑料盤中，用火焰滅菌的壁紙刀将培養物縱向切取整體的1/4，進行濕篩。在體視顯微鏡下檢查菌絲量及孢子繁殖情況，無侵染或無孢子的丢棄。
5. 有孢子或有較多菌絲的樣品繼續培養。将消毒的塑料花盆中裝入滅菌的沸砂基質至1/3處，上述檢查後确定已有孢子的剩餘3/4培養物與高梁苗，直立于1加侖塑料花盆的中心位置，周圍添加滅菌的沸砂基質到花盆3/4處，用潔淨的水澆透，播種催芽的高梁種子30-50粒/盆，覆蓋0.5-1 cm滅菌基質，澆少量潔淨的水。
6. 放置光照培養室培養至少3個月，培養條件參見“質量控制”部分。在植物缺水時适量澆潔淨的水，在植物顯示缺肥時補澆适量20%的霍格蘭營養液。
