野外調查及樣品采集
準備需要的采樣工具 (一次性無菌PE手套、小鐵鍬、消毒濕紙巾、剪刀和枝剪、塑料自封袋、标簽紙、鉛筆、記号筆、布袋、照相機、采樣記錄本、GPS等)，根據采樣目的選擇調查地點、樣點和長勢良好的寄主植物，記錄調查地點的行政區劃名稱、地理坐标、地形、植被、土壤類型、土壤質地、寄主植物名稱及生長狀況等，并對生境拍照。 去除地表枯枝落葉、大塊砂石和其他雜物，用小鐵鍬 (消毒濕紙巾擦拭幹淨) 沿寄主植物周圍垂直向下...
華東地區AMF菌種保藏與研發中心
East China AMF Strain Collection and R&D Center
研究方法
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誘導培養
誘導培養通常是為獲得單一菌種資源的必要條件。野外直接收集的孢子可能存在如下問題：1) 看似健康，但實際沒有活力。2) 由于根的色素、土壤理化性質及土壤微生物的影響而失去或改變其原有結構特征。3) 直接采集的土壤樣品中僅僅是那些有足夠活性和生物量并結孢子的種，而誘導培養會産生不同的結果。為避免資源的遺漏和減少鑒定工作的誤差，樣品采集後，應在溫室内利用原始土壤作為培養基質進行誘導培養，以獲得健康的孢子作為...
單孢培養
單孢培養即純種的建立，也稱純化培養。無論是野外或田間采集的土壤，還是誘導培養後，獲得的大量AMF孢子都是不同的屬種混合在一起，必須将形态上不同的孢子分别挑出來接種到宿主植物上進行純化培養，即可收集到足量的、純淨的AMF菌種資源。 單孢培養是從小心仔細地選擇孢子開始的。孢子可以從田間得到，隻要是健康并能侵染的都可以，但成功的可能性由于土壤類型、有機質含量和環境狀況或季節有很大的差異。步驟：1. 接種前3-4 ...
菌劑擴繁培養
擴繁培養包括單孢擴繁培養和菌劑擴繁培養，是為了獲得足夠量的純化菌種而進行的盆栽培養。可用單孢培養物（含有孢子、侵染的根段或菌絲），也可以用純化菌種的培養物。步驟：1. 在稱樣區内，稱取待擴繁菌種樣品50-100 g備用，或在體視鏡下挑取待擴繁菌種的孢子50-200個備用。2. 按質量控制要求準備高粱種子（參見“質量控制”部分）、滅菌的沸砂基質、1加侖塑料花盆和潔淨的水，備用。3. 塑料花盆中裝入滅菌的沸砂基質至2/3處...
收獲與重種
誘導培養（或擴繁培養）在光照培養室培養至少3個月以後，準備收獲。1. 先将花盆置于溫度濕度相對穩定的房間内幹燥（根據所在地區相應調整，北方城市和南方城市的冬天可以直接在無光照的室内自然晾幹，南方城市在空氣濕度較高的季節建議用空調及除濕機等調整空氣溫濕度，保證約1-2周時間内培養物幹燥），然後收獲所有盆中培養物（包括植物根系、菌絲、孢子和基質）。2. 操作人員雙手洗淨并用吸水紙擦幹後，帶一次性PE手套将桌面...
菌種儲存
裝袋準備保藏的培養物按屬種順序放置于冷藏室或4 °C冰箱中保存。AMF通常保藏盆栽的“全培養物”，即剪去植株地上部分後培養容器中的所有基質、根系、孢子和菌絲。由于根系在長期保存過程中，容易黴變，滋生其他微生物，可以選擇去除不保藏。最好使用4 °C種子櫃保存培養物，如果條件不具備也可使用風冷冰箱或冷藏室（空調控溫16-18 °C）保存
質量控制
由于AMF菌種資源收集與保藏的各個步驟 (包括：誘導培養、單孢培養、擴繁培養、取樣、檢查、收獲等) 都是在開放或半開放的有菌環境下進行，并且培養時間較長 (一般3個月以上)，因此，必須盡量保持操作和培養空間潔淨，寄主植物健康，盡可能降低植物病原物、腐生生物和昆蟲等的滋生、有毒或有害物質的污染等。1. 寄主的選擇與種子消毒：一般選用對AMF依賴性較大、對菌種專一性較小、根系較發達，适合溫室盆栽的植物。已經成功運用...
孢子提取與清洗
方法：土壤或盆栽培養物中AMF孢子的分離提取采用濕篩傾析法。工具：土壤标準篩（孔徑為上層0.8 mm，中層0.25 mm，下層0.055 mm）、攪拌器。流程：稱取菌劑或土壤放入攪拌機燒杯中→加水至杯1/3→高速攪拌10~15 s →懸液依次通過3個土壤标準篩→反複沖洗菌劑或土壤直到懸液清澈（大部分粗沙礫殘餘物留在燒杯中）→流水沖洗每層篩子直至流出清水→用洗瓶将篩中的殘餘物輕輕沖洗彙集到篩子的一邊→倒入培養皿中→體式顯微鏡下觀察...
清潔孢子的分離
在體視顯微鏡下，将濕篩分離出的外表健康的孢子人工轉移至表面皿中的自來水裡，小心、仔細地檢查，除去所有的菌絲和碎屑，表面皿置于培養皿中以減少蒸發，或放在有蓋的瓶中并于4℃下至少存放48 h。然後再小心地重新檢查，挑出并丢棄任何看上去不正常的孢子，如：變色、有斑、内含物異常、過度透明或在孢子表面有細菌或真菌生長等。換水後，再将孢子貯于4℃下24~48 h再觀察，去掉不典型的孢子，然後水洗留在表面皿或轉移至放有滅...
形态鑒定方法
制片：獲得同種的潔淨孢子、孢子果和根段（如有）後，平均分為4份，分别以乳酸、乳酸+Melzer’s試劑、PVLG、PVLG+Melzer’s試劑為浮載劑制作裝片。取出載玻片并确保幹淨（南方潮濕環境容易長雜菌）；在載玻片一端粘貼或書寫标簽（包括菌種編号，浮載劑類型及制片日期）；在體式鏡下，将其中一份孢子盡量聚攏，用移液槍或吸管吸取孢子置于玻片上（盡量減少水的吸取），玻片自然晾幹直至孢子周圍的水幾乎變幹時，滴加相應的浮載劑...
分子生物學鑒定方法
DNA提取：1. 從純化的培養物篩取孢子，挑出有活力的孢子，用滅菌的蒸餾水洗淨；2. 将3-20個孢子用移液器轉移到1.5 mL的滅菌離心管底部，使水盡量少，将裝有孢子的離心管置于冰上；3. 将水浴鍋開到94℃，将Taq聚合酶配套的buffer解凍後置于冰上；4. 用槍頭将孢子搗碎，使其内容物釋放出來。該過程也要在體視鏡下進行，以便能看到孢子和确保内容物（包含DNA）釋放出來。因為孢子周圍液體很少，因此不會有太多滑動。5. 将槍頭在離...
根系侵染率測定方法
不同物種條件不同，需要優化，下面以瀕危植物夏蠟梅為例。根據Phillips和Hayman（1970）提出的台盼藍（曲利苯藍）的染色方法來測定夏蠟梅菌根侵染率，主要包括透明、漂白、酸化、染色和脫色等步驟。1、 根樣采集從植物根部選擇顔色相對較淺，最細一級的根（多條根相加總長不少于40 cm）放入FAA固定液固定24 h以上備用，或冷凍保存備用。注：根樣的采集應具有代表性，如果是從多個植物根系收集，應分别每株取樣後再進行混合取樣...