華東地區AMF菌種保藏與研發中心
East China AMF Strain Collection and R&D Center

根系侵染率測定方法

不同物種條件不同,需要優化,下面以瀕危植物夏蠟梅為例。

根據Phillips和Hayman(1970)提出的台盼藍(曲利苯藍)的染色方法來測定夏蠟梅菌根侵染率,主要包括透明、漂白、酸化、染色和脫色等步驟。

1、 根樣采集

從植物根部選擇顔色相對較淺,最細一級的根(多條根相加總長不少于40 cm)放入FAA固定液固定24 h以上備用,或冷凍保存備用。

注:根樣的采集應具有代表性,如果是從多個植物根系收集,應分别每株取樣後再進行混合取樣;如果是單株植物,應分别從不同部位取樣後再混合取樣,如果取樣後直接做實驗的話可以不用固定。取根系時為了減少對根外菌絲的破壞,動作盡量輕柔,根系允許帶一些泥土。

2、 透明

将根從FAA固定液中取出,蒸餾水浸洗數次後剪成1cm長根段,放入50ml離心管中,加入20%的KOH溶液、擰好蓋子放入裝有水的燒杯(500 ml或250 ml),将燒杯置于90 ℃水浴鍋水浴3 h。

注:其目的在于除去根部皮層細胞中的細胞質,便于以後染色處理時染料的盡快滲透。

3、 清洗

将離心管取出,倒去KOH,用清水輕輕漂洗根樣數次,但勿用力攪動,以防根樣表面的根外菌絲脫落,當水不再呈黃色時即可。

4、 漂白

向裝有清洗好的根的離心管中加入堿性H2O2浸泡,在室溫條件下放置1 h(人工種植的根系40min),當根系的顔色由棕色變白即可。

5、 再清洗

輕輕倒去離心管中的堿性H2O2溶液,用清水漂洗幾次。

6、 酸化

向裝有清洗好的根的離心管中加入2%的HCl,室溫酸化4 min。

注:酸化時間過長根會變爛。

7、 染色

輕輕倒出HCl,加入0.05%的台盼藍乳酚染液,再放回水浴鍋90 ℃水浴30 min。

注:回收染色液可重複再利用,但是效果有待進一步确認。

8、 脫色

取出上述已染色的根段,蒸餾水換洗數次後,用乳酚試劑脫色,常溫脫色2 h - 3 h直到根樣中多餘的染料大部分被清除為止。

9、 制片

将根段置于塗有封固劑的載玻片上進行制片,一張載破片上可放2~3條根,蓋上潔淨的蓋玻片,加壓使根破碎,并除去其中氣泡。記錄玻片編号及制片時間。


   10、觀察

觀察制作好的載玻片于200倍生物顯微鏡下觀察菌根侵染情況。


藥品配制:

1、 FAA固定液配制(可多配一點)

50% 酒精90 ml、冰醋酸5 ml、37%甲醛5 ml、加入5 ml甘油防止揮發

2、 20% KOH溶液配制(可多配一點)

20 g溶于100ml蒸餾水中

3、 堿性H2O2

2ml 30%的H2O2 + 0.3 ml氨水,加水至55ml

注:随配随用,不能放置過久

4、 2% HCl溶液配制(可多配一點)

10 ml 分析純鹽酸(36%)加入175ml蒸餾水中

5、 乳酚試劑:

苯酚:乳酸:甘油:蒸餾水=1:1:2:1(v/v)

6、 0.05% 台盼藍乳酚染液

0.5 g台盼藍加入1000 ml乳酚試劑中

7、 浮載劑(PVLG)

聚乙烯醇1.66 g + 甘油1 ml + 乳酸10 ml + 蒸餾水10 ml

注:聚乙烯醇很難溶解,可以将溶液置于90 ℃水浴鍋水浴溶解。

   酸性酒精:5%醋酸  90%酒精 5%雙氧水(脫色可選擇用酸性酒精)





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